NISA口座で同一銘柄を2回に分けて買付けた場合、売却する際に、2回目に取得した分のみ売却するといった指定はできますか？

できません。
NISA口座では取得単価という考え方ではなく、合計買付金額という考え方を採用しています。
そのため、売却時には先入れ先出し法となります。